Явление трансформации было открыто Ф. Гриффитом в 1928 г. в
опытах на пневмококках (Streptococcus pneumoniae) – грамположитель-
ных бактериях, относящихся к группе молочнокислых бактерий. Ко вре-
мени открытия явления трансформации свойства пневмококков были
изучены достаточно хорошо. В частности, было известно, что среди
пневмококков одного и того же вида, кроме штаммов, имеющих полиса-
харидную капсулу, обычно есть и бескапсульные варианты, получаю-
щиеся в результате мутаций. Было также установлено, что наличие и от-
сутствие капсулы определяет некоторые важные свойства клеток. Клет-
ки, обладающие капсулой, растут в виде так называемых S-колоний: сли-
зистых, довольно крупных и с гладкой поверхностью. Бескапсульные
клетки дают начало мелким, с неровной поверхностью (шероховатым)
R-колониям. За счет наличия капсулы бактерии из S-колоний обладают
вирулентными свойствами и вызывают септицемию, размножаясь прак-
тически беспрепятственно в организме хозяина так как капсула защища-
ет их от фагоцитирующих клеток. Бескапсульные клетки являются ави-
рулентными. Было установлено, что существует большое число различ-
ных штаммов пневмококков, которые отличаются друг от друга по хи-
мическому составу полисахаридной капсулы и которые можно различить
серологически. Сейчас известно около 70 серотипов пневмококков.
Трансформация была открыта в одном из вариантов опытов по имму-
низации мышей вакциной, состоящей из пневмококков, убитых нагрева-
нием при температуре 60–80 ºС. Ф. Гриффит обнаружил, что если мы-
шам подкожно ввести смесь живых бескапсульных клеток (R) и убитых
нагреванием вирулентных пневмококков (S), имеющих капсулу, то мы-
ши погибают. Из органов мышей при этом можно выделить живые кап-
сульные клетки пневмококков.
Если мышам вводили живые авирулентные (R) клетки пневмококков
и убитые вирулентные (S) клетки пневмококков разных серотипов (клет-
ки имели разные антигены), то выделенные из органов мыши капсульные
клетки имели измененный серотип – тот, к которому принадлежали уби-
тые S-пневмококки. В контрольных опытах введение по отдельности та-
кого же количества живых авирулентных пневмококков или убитых ви-
рулентных не приводило к появлению живых капсульных форм.
Чтобы доказать отсутствие случайного загрязнения бескапсульной
культуры отдельными капсульными клетками, был поставлен экспери-
мент с использованием клеток пневмококков, меченых специфическим
соматическим белковым антигеном или маркерами лекарственной ус-
тойчивости. Известно, что эти свойства клеток изменяются независимо
от капсульного полисахарида.
SII(M2′) RII(M2′) + SIII ///SIII(M2′)
Так было доказано отсутствие случайного загрязнения бескапсульной
культуры отдельными капсульными клетками.
На основании полученных результатов Ф. Гриффит сделал вывод, что
существует трансформирующее начало, которое превращает бескапсуль-
ные клетки одного серотипа в капсульные клетки другого серотипа.
В 1930 г. М. Даусон установил, что выдерживание суспензии клеток
в течение двух суток при температуре 37 ºС уничтожает трансформи-
рующую активность таких бактерий. В 1931 г. М. Даусон и Р. Сиа осу-
ществили трансформацию не в организме мыши, а in vitro, смешав уби-
тые нагреванием капсульные клетки и живые бескапсульные пневмокок-
ки в жидкой питательной среде с добавлением крови. Позднее в 1932 г.
Дж. Аллоуэй осуществил специфическую трансформацию in vitro в при-
сутствии бесклеточных экстрактов, полученных из клеток S-типа. Пнев-
мококки были разрушены замораживанием-оттаиванием или дезоксихо-
латом натрия, и лизат несколько раз переосаждали спиртом. Полученный
осадок растворяли и смешивали с бескапсульными живыми клетками, в
результате с высокой частотой происходило образование капсульных
клеток.
Таким образом, в работах 1928–1933 гг. доказано существование
трансформации у пневмококков. Было установлено, что это явление мо-
жет происходить как в организме животного, так и in vitro, а также, что
для трансформации необходим какой-то фактор, который не инактиви-
руется при обработке лизата клеток спиртом.
Интерес к опытам по трансформации возродился в 1944 г., когда бы-
ла опубликована классическая работа О. Эвери, К. Мак-Леода и М. Мак-
Карти. Они установили, что трансформацию можно воспроизвести, ис-
пользуя в качестве трансформирующего агента препарат очищенной
ДНК, полученный из капсульных клеток. Методика эксперимента за-
ключалась в следующем. Капсульные клетки пневмококков типа III (SIII),
убитые нагреванием при температуре 65 ºС, лизировали с помощью де-
зоксихолата натрия и лизат осаждали спиртом. Полученный осадок рас-
творяли и из него удаляли белок и полисахариды. После нескольких до-
полнительных переосаждений спиртом получали препарат ДНК, содер-
жащий только 3 % белка. Этим препаратом ДНК обрабатывали бескап-
сульные клетки типа II (RII). Частота выявления трансформантов (SIII-
типа) была высокой. В этой же работе и в работах двух последующих лет
изучены некоторые типы воздействий, инактивирующих полученный
препарат из капсульных клеток, убитых нагреванием. Оказалось, что
протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, проназа) и РНКаза
не снижали трансформирующую активность препарата, но действие
ДНКазы ингибировало ее полностью. Был сделан вывод, что трансфор-
мирующим началом является ДНК. Позднее было показано, что при ис-
пользовании в качестве трансформирующих препаратов меченой радио-
активным фосфором (32Р) ДНК, метка необратимо встраивается в ДНК
бактерий-реципиентов. Более того, между степенью включения метки и
числом образующихся трансформантов существует прямая зависимость.
В настоящее время трансформация, кроме пневмококков, воспроиз-
ведена и на других видах микроорганизмов: Escherichia coli, Bacillus subtilis,
гемофильных бактериях (Haеmophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae)
и др. Трансформацию удалось осуществить не только меж-
ду бактериями одного и того же вида, но и между бактериями, принад-
лежащими к разным видам. Однако межвидовая трансформация наблю-
дается, как правило, лишь у близкородственных бактерий и происходит с
меньшей частотой, чем внутривидовая. В начале 1970-х годов было по-
казано, что трансформировать клетки можно не только хромосомной, но
и плазмидной ДНК. Плазмиды после этого нормально функционировали
и реплицировались в реципиентных клетках.
Процесс трансформации, начиная с момента добавления ДНК из кле-
ток донорного штамма к культуре реципиента, в общих чертах включает
следующие этапы, или стадии.
1. Адсорбцию донорной ДНК на поверхности реципиентной клетки.
На этом этапе трансформирующий фактор чувствителен к ДНКазе.
2. Поглощение донорной ДНК реципиентной клеткой. Причем ДНК
может поглощаться только теми клетками, которые находятся в состоя-
нии компетентности. На этой стадии ДНК уже нечувствительна к дейст-
вию ДНКазы.
3. Образование в реципиентной клетке однонитевых фрагментов до-
норной ДНК.
4. Синапс одноцепочечной донорной ДНК с двухцепочечной хромо-
сомой реципиента.
5. Интеграцию части донорной молекулы ДНК в реципиентную ДНК
в результате рекомбинации.
6. Репликацию рекомбинантной молекулы ДНК.
7. Экспрессию генов, переданных от донора, т. е. образование транс-
формантов.
|