Под ростом понимают согласованное увеличение количества всех
химических компонентов, формирующих клеточные структуры. Рост
клеток обычно сопровождается увеличением их массы и размеров. Одна-
ко эта закономерность наблюдается не всегда, так как в некоторых усло-
виях клетки способны просто накапливать запасные или резервные ве-
щества, т. е. масса может увеличиваться, но роста при этом не наблюда-
ется. В подходящей же среде, к которой бактерии полностью адаптиро-
ваны, они находятся в состоянии сбалансированного роста. В период
сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением
всех других учитываемых параметров популяции, например количества
белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. Иными словами, культуры,
растущие сбалансированно, сохраняют постоянный химический состав.
В условиях сбалансированного роста легко определить величину скоро-
сти роста бактериальной популяции в каждый момент времени, если из-
мерить прирост любого компонента клетки по отношению к его исход-
ному количеству. Таким образом, в культуре, растущей сбалансирован-
но, скорость прироста вещества клеток в любой данный момент пропор-
циональна числу или массе имеющихся в это время бактерий. Коэффи-
циент пропорциональности называют удельной скоростью роста (μ).
Данная величина отличается для разных культур, и даже для одной куль-
После интегрирования и перехода к десятичным логарифмам полу-
чим формулу для определения удельной скорости роста (ч–1)
Если рост клеток в культуре ограничен количеством внесенного в пи-
тательную среду компонента, то между его начальной концентрацией и
полученной биомассой клеток существует постоянная линейная зависи-
мость (при условии ограничения роста только по одному параметру).
Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента
среды, представляет собой величину, которую называют экономическим
коэффициентом (или выходом биомассы) – Y. Эту величину определя-
ют по уравнению
где Х – масса сухого вещества клеток (г/мл культуры), вступившей в
стационарную фазу роста; Х0 – масса сухого вещества клеток в 1 мл сре-
ды сразу после инокуляции среды; (Х – Х0) – урожай бактериальной
культуры (урожай зависит от количества и природы используемых пита-
тельных веществ, а также от условий культивирования); (S0 – S) – коли-
чество потребленного субстрата (компонента среды).
В лабораторных и промышленных условиях используют два основ-
ных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (стати-
ческое) и непрерывное (проточное).
Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока
содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питатель-
ной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если
на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не
удалять конечных продуктов метаболизма, то получается так называемая
периодическая культура (популяция клеток в ограниченном жизненном
пространстве).
Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодиче-
ском культивировании от длительности инкубирования описывается
характерной кривой, которая имеет S-образную форму (рис. 30). На кри-
вой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в оп-
ределенной последовательности: начальную (или лаг-) фазу; экспонен-
циальную, или логарифмическую, фазу; стационарную фазу; фазу отми-
рания.
Лаг-фаза, или фаза задержанного роста, охватывает промежуток
времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максималь-
ной скорости деления. В клетках бактерий в этот период идут в основном
процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования
(составу среды, температуре, рН и т. п.). Продолжительность фазы опре-
деляется следующими факторами.
• Начальными условиями культивирования вносимого посевного ма-
териала. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются
от тех, которые были в предшествующей культуре, то для приспособле-
ния к новым условиям в клетке должен быть синтезирован набор
ферментов, потребность в которых ранее отсутствовала и поэтому они в
ней не синтезировались. Этот процесс индуцируется внесением нового
субстрата. Если проанализировать химический состав бактериальной
клетки в течение лаг-фазы, то можно отметить, что во время нее проис-
ходит быстрое увеличение количества РНК (в 8–12 раз).
• Возрастом посевного материала: чем старше культура, которую ис-
пользуют для инокуляции новой питательной среды, тем большее время
занимает лаг-фаза, хотя при значительном количестве засеваемого актив-
но делящегося посевного материала культура может развиваться без лаг-
фазы.
Во время лаг-фазы деления клеток не происходит, отмечаются лишь
процессы, подготавливающие клетку к размножению.
Лаг-фаза переходит в начальную фазу размножения, или фазу ускоре-
ния роста, когда клетки начинают делиться с постепенно увеличиваю-
щейся скоростью.
Фаза экспоненциального (логарифмического) роста характеризует-
ся постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью
роста. Для различных видов бактерий эти величины могут варьировать в
значительных пределах. Например, бактерии E. coli при 37 ºС делятся
примерно каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter –
5–10 ч. Культуры бактерии E. coli вступают в стационарную фазу при
концентрации клеток 2–5 . 109/мл.
Во время экспонециальной фазы все клетки в популяции имеют при-
близительно одинаковый размер, содержат максимальное количество
РНК, количество белка в них также максимально и постоянно. Во время
экспоненциальной фазы клетки наиболее жизнеспособны и обладают
высокой биохимической активностью.
Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных
клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость раз-
множения бактерий равна скорости их отмирания. В связи с тем, что
скорость роста определяется концентрацией субстрата, то еще до его
полного использования начинает снижаться и скорость роста, поэтому
переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит посте-
пенно. Скорость роста может снижаться не только из-за недостатка суб-
страта, но и вследствие высокой плотности бактериальной популяции,
при низком парциальном давлении кислорода или по причине накопле-
ния токсичных продуктов обмена. Все эти факторы обусловливают пере-
ход к стационарной фазе. Переход в стационарную фазу включает пери-
од несбалансированного роста, когда компоненты клеток синтезируются
с различными скоростями, соответственно и содержание отдельных хи-
мических веществ в клетках на разных стадиях отличается.
Химический состав клеток зависит от фактора, лимитирующего рост.
Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК,
более устойчивы к различного рода воздействиям (физи-ческим и хими-
ческим), чем в экспоненциальной фазе роста культур. В этот период в
клетках или в среде культивирования нередко накапливаются продукты
вторичного метаболизма (антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.).
Продолжительность этой фазы может быть от нескольких часов до не-
скольких дней в зависимости от вида микроорганизма.
В стационарную фазу роста поведение клеток в бактериальной попу-
ляции может регулировать явление, которое получило название апоп-
тоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного суб-
страта голодающая популяция бактерий разделяется на две субпопуля-
ции, одна из которых погибает и подвергается автолизу, клетки же дру-
гой популяции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают
размножаться. Установлен механизм генетического контроля апоптоза у
бактерий E. coli. Он осуществляется особым опероном maz, представлен-
ным двумя генами: mazE и mazF. Продукт гена mazF – стабильный цито-
токсический белок-киллер, а продукт гена mazE – нестабильный белок
МazE, разрушающий белок-киллер. Истощение фонда аминокислот в пи-
тательной среде приводит к блокированию экспрессии оперона maz, в ре-
зультате синтез белка МazE прекращается и белок-киллер вызывает ги-
бель и автолиз части популяции. В среде пополняется фонд аминокислот,
синтез белка МazE у оставшихся живых клеток активируется, и они про-
должают размножаться.
В фазе отмирания происходит экспоненциальное снижение числа
живых клеток. Скорость отмирания бактерий существенно варьирует в
зависимости от условий среды и физиологических особенностей орга-
низма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от не-
которых видов бактерий рода Bacillus, скорость гибели которых проис-
ходит быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными. Это и
накопление органических кислот (как у бактерий родов Escherichia, Lactobacillus),
автолиз (лизис над действием собственных ферментов), нако-
пление антибиотиков, бактериоцинов и др.
В условиях непрерывного (проточного) культивирования в сосуд,
содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и
из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганиз-
мов. Это позволяет на длительное время задержать культуру в состоянии
экспоненциального роста.
Проточное культивирование осуществляется в аппаратах (ферменте-
рах) двух типов: хемостатах и турбидостатах. Хемостат состоит из со-
суда-культиватора, в который с заданной постоянной скоростью посту-
пает питательная среда. Для равномерного и полного смешения пита-
тельных веществ содержимое культиватора механически перемешивает-
ся и аэрируется стерильным воздухом. Избыточная биомасса клеток с
питательной средой вытекает из культиватора через сливной сифон. В
хемостате прирост биомассы прямо пропорционален скорости притока
субстрата и удаления продуктов метаболизма. Примером хемостата в
природе служит рубец жвачных животных.
Турбидостат представляет собой ферментер, в котором поддержива-
ется заданная плотность клеток за счет определения оптической плотно-
сти среды культивирования. Когда количество биомассы увеличивается
относительно некоторого выбранного уровня, что фиксируется фото-
элементом, соединенным с системой реле, включается подача свежей пи-
тательной среды.
Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промыш-
ленных и лабораторных условиях применяют биореакторы, или фермен-
теры. Они представляют собой герметические котлы, в которые залива-
ется жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими
приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную темпера-
туру, оптимальное значение рН и редокс-потенциал, дозированное по-
ступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они снабже-
ны системами перемешивания, аэрирования, охлаждения, пеногашения.
Непрерывное культивирование широко используется в промыш-
ленной микробиологии, а также при проведении физиологических, био-
химических и генетических исследований, так как в данных условиях
наблюдается константная плотность популяции и концентрация всех
компонентов питательной среды.
Для изучения процессов обмена веществ на протяжении цикла кле-
точного деления часто необходимо, чтобы все клетки в популяции дели-
лись одновременно (синхронно). Культуры, в которых все клетки нахо-
дятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно,
называют синхронными. Синхронизировать рост и деление клеток в ка-
кой-либо популяции можно различными искусственными приемами, та-
кими как изменение температуры, изменение интенсивности освещения
(для фототрофных микроорганизмов), лимитирование количества пита-
тельных веществ или фильтрование суспензии клеток микроорганизмов
через специальный фильтр, позволяющий отобрать клетки одного разме-
ра. Однако в синхронизированном состоянии культура не может нахо-
диться длительное время и после двух-трех генераций процесс деления
клеток асинхронизируется.
Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов на-
ходит широкое применение в биотехнологии, а именно в производстве
ценных органических веществ, в деградации токсичных природных и не-
природных соединений, а также промышленных отходов, для очистки
сточных вод от загрязнений.
Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорга-
низмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют два принци-
пиально различных подхода к иммобилизации: без образования кова-
лентной связи между клеткой и носителем (физические) и с образовани-
ем ковалентной связи между ними (химические).
Химические методы иммобилизации предполагают образование ко-
валентной связи между какой-либо из функциональных групп на поверх-
ности клетки микроорганизма и материалом носителя. Они методы при-
меняются сравнительно редко, так как клетки в этом состоянии могут те-
рять нужную активность.
Физические методы иммобилизации реализуются в результате ад-
сорбции микроорганизмов на поверхности различных нерастворимых
синтетических или природных пористых материалов, при включении
клеток в поры поперечносшитого геля и т. п. Например, при смешивании
суспензии клеток с раствором полимера (полиакриламид, агароза и т. п.)
с последующей полимеризацией образуется пространственная структура
геля с включенными в его ячейки клетками микроорганизмов. В резуль-
тате микроорганизмы оказываются заключенными в ячейки, которые ог-
раничивают их перемещение, но не препятствуют поступлению пита-
тельных веществ и осуществлению каталитических функций.
В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток
путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена,
казеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммо-
билизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку,
через которую пропускают субстрат.
Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную ак-
тивность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих
технологических процессах. При этом облегчается выделение продуктов
биосинтеза.
|