5.3. Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях - Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки - Каталог статей - Общая биология 10-11 классы
Главная | Регистрация | Вход | RSSСреда, 07.12.2016, 19:22

Биология 10-11 класс

Меню сайта
Категории раздела
Введение [30]
Глава1.Основы цитологии [16]
Глава 2.Размножение и индивидуальное развитие организмов [14]
Глава 3. Основы генетики [16]
Глава 4. Генетика человека [12]
Глава 5.Основы учения об эволюции [11]
Глава 6. Основы селекции и биотехнологии [10]
Глава 7. Антропогенез [11]
Глава 8. Основы экологии [10]
Глава 9. Эволюция биосферы и человек [11]
Биологический словарь на букву "А" [54]
Биологический словарь на букву "Б" [56]
Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки [49]
Глава 11.О чем умолчали учебники [36]
7 [18]
Категории раздела
Введение [30]
Глава1.Основы цитологии [16]
Глава 2.Размножение и индивидуальное развитие организмов [14]
Глава 3. Основы генетики [16]
Глава 4. Генетика человека [12]
Глава 5.Основы учения об эволюции [11]
Глава 6. Основы селекции и биотехнологии [10]
Глава 7. Антропогенез [11]
Глава 8. Основы экологии [10]
Глава 9. Эволюция биосферы и человек [11]
Биологический словарь на букву "А" [54]
Биологический словарь на букву "Б" [56]
Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки [49]
Глава 11.О чем умолчали учебники [36]
7 [18]
Наш опрос
Оцените мой сайт
Всего ответов: 40
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Форма входа

Каталог статей

Главная » Статьи » Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки

5.3. Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях
Для культивирования микроорганизмов используются различные по
составу питательные среды, в которых должны содержаться все вещест-
ва, необходимые для роста. В связи с тем что конструктивные и энерге-
тические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, универ-
сальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения мик-
роорганизмов, не существует.
Основными компонентами любой питательной среды для культиви-
рования микроорганизмов являются источники углерода и азота. Их ко-
личественное отношение определяет специфичность подавляющего
большинства сред.
Для культивирования автотрофных микроорганизмов необходимо
обеспечить клетки углекислым газом, так как его концентрация в воздухе
не превышает 0,03 % и поступление в среду за счет диффузии недоста-
точно для интенсивного роста микроорганизмов. В среды для культиви-
рования автотрофов вносят чаще всего карбонат кальция (СаСО3), можно
также вносить гидрокарбонат натрия (NaHCO3) или другие карбонаты. В
некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обога-
щенный 1–5 % углекислого газа.
Потребности гетеротрофов в углероде не могут быть удовлетворены
при использовании СО2. Для их развития среда должна содержать источ-
ник углерода в виде органических соединений. В зависимости от инди-
видуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны ис-
пользовать различные соединения – органические кислоты, спирты, уг-
леводы, углеводороды, ароматические соединения и др. Но в лаборатор-
ной практике в качестве источника углерода чаще всего применяют глю-
козу, так как это наиболее легко утилизируемое микроорганизмами со-
единение углерода.
Вторым по значимости компонентом питательной среды является
азот. Азот входит в состав органических веществ клетки главным обра-
зом в восстановленной форме – в виде амино (–NH2–)- или имино
(–NH–)-групп. Потребности микроорганизмов в источнике азота могут
быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями, в ко-
торых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих
микроорганизмов это могут быть и соли аммония, которые вносят в сре-
ду в виде хлоридов или сульфатов. Однако следует помнить, что аммо-
нийные соли – физиологически кислые вещества, по мере использования
иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты,
что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может от-
рицательно повлиять на развитие микроорганизмов.
Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут
быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирова-
ния таких микроорганизмов содержат нитраты в виде солей калия или
натрия. В отличие от солей аммония, нитраты физиологически щелочные
соединения, так как при использовании аниона в среде накаплива-
ются катионы К
-3
NO
+ или Na+. Нитриты для многих микроорганизмов ток-
сичны, поэтому в качестве источника азота практически не исполь-
зуются.
Наиболее требовательные к азоту микроорганизмы культивируют на
питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного гид-
ролиза – пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли- и олигопеп-
тидов, аминокислот, органических азотистых оснований, солей и микро-
элементов. Их получают в результате воздействия протеолитическими
ферментами на белки животного (мышечный белок, казеин) или расти-
тельного (соевая мука) происхождения. Необходимо иметь в виду, что
микроорганизмы могут использовать пептон не только как источник азо-
та, но и как источник углерода и энергии.
Кроме источников углерода и азота, микроорганизмам для построе-
ния веществ клетки необходимы также соединения серы, фосфора, ка-
лия, магния, кальция и других макроэлементов. Все они должны содер-
жаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме.
Потребности в этих элементах удовлетворяются обычно за счет мине-
ральных солей. Так, потребности подавляющего большинства микроор-
ганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера нахо-
дится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных
групп. Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроор-
ганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы (калий, натрий, кальций,
марганец) и другие элементы микроорганизмы получают в форме катио-
нов или анионов неорганических солей. Например, источником магния
служит, как правило, MgSO4, натрия – NaCl, кальция – CaCO3 или CaCl2.
Помимо макроэлементов, многие микроорганизмы требуют наличия в
среде так называемых факторов роста. Факторы роста могут быть двух
типов: неорганические и органические. К неорганическим факторам
роста относятся микроэлементы – Co, Zn, Mo, Mn, Fe, Cu и др. Они вхо-
дят в состав активных групп многих ферментов. В качестве органических
факторов роста можно выделить витамины, пуриновые, пиримидиновые
основания, аминокислоты. Факторы роста добавляют в питательную сре-
ду в значительно меньших количествах, чем макроэлементы. Следует
помнить, что микроорганизмы усваивают аминокислоты в L-, а не в
D-форме.
Потребности микроорганизмов сразу в нескольких аминокислотах
часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения
гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, казе-
ин) или растительного (семена сои, подсолнечника, кукурузы) происхо-
ждения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бакте-
рии). Гидролиз проводят с использованием протеолитических фермен-
тов, кипячением минеральных кислот или крепких щелочей.
Некоторые натуральные вещества, к числу которых относятся дрож-
жевой или кукурузный экстракт, содержат сразу несколько различных
факторов роста (витамины, минеральные соли, аминокислоты).
Все питательные среды по составу делятся на натуральные и синтети-
ческие. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов
животного или растительного происхождения. К средам такого типа от-
носятся овощные или фруктовые соки, ткани животных, молоко, отвары
мяса, вытяжки почвы, различные части растений, клетки микроорганиз-
мов. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганиз-
мы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для
их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный
химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ мик-
роорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонен-
тов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды исполь-
зуются главным образом для поддержания культур микроорганизмов,
накопления биомассы и для диагностических целей.
Синтетические среды – это среды, в которые входят соединения оп-
ределенного химического состава, взятые в точно указанных количест-
вах. Они широко используются при исследовании обмена веществ, фи-
зиологии и биохимии микроорганизмов.
Наряду с натуральными и синтетическими выделяют полусинтети-
ческие среды. Главными компонентами полусинтетических сред являют-
ся соединения известного химического состава – углеводы, соли аммо-
ния или нитраты, фосфаты и др. Однако в них всегда включаются веще-
ства неопределенного состава, такие как дрожжевой, почвенный, куку-
рузный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое
применение в промышленной микробиологии для получения аминокис-
лот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедея-
тельности микроорганизмов.
По назначению среды подразделяют на элективные и дифференци-
ально-диагностические. Элективные среды предназначены для выделе-
ния микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они обеспечи-
вают преимущественное развитие определенной физиологической груп-
пы микроорганизмов. Дифференциально-диагностические среды дают
возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других и
выявить некоторые их особенности. Эти среды особенно широко приме-
няются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой иден-
тификации микроорганизмов. Примером таких сред являются среды Гис-
са, которые используются для изучения сахаролитических свойств мик-
роорганизмов, т. е. способности ферментировать те или иные углеводы и
спирты.
В состав среды Гисса входит основной фон (пептон и K2HPO4), инди-
катор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, Андреде и
др.) и один из изучаемых углеводов или спиртов. Различают малый и
большой пестрый ряд Гисса. В малый ряд Гисса входят следующие угле-
воды и спирты: глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза и маннит. В боль-
шой пестрый ряд Гисса входят, кроме тех, что образуют малый ряд, дру-
гие углеводы и спирты, например арабиноза, рамноза, сорбит, дульцит
и т. д. Среды Гисса можно использовать в жидком или полужидком со-
стоянии. В последнем случае к жидкой среде добавляют 0,5 % агара.
Рост микроорганизмов на средах Гисса может приводить к накоплению
органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Выделение этих
продуктов регистрируется по изменению рН среды. Например, если сре-
да Гисса содержит индикатор бромтимоловый синий, то цвет ее будет
изменяться в зависимости от рН следующим образом: рН = 7,0 – зеле-
ный; рН > 7,0 – синий; рН < 7,0 – желтый.
По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие, плотные,
или твердые, среды. Жидкие среды применяют для накопления биомас-
сы или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии
микроорганизмов. Сыпучие среды применяют главным образом в про-
мышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцен-
тов физиологически активных соединений. К таким средам относятся,
например, разваренное пшено, отруби и др. Плотные среды используют
для выделения чистых культур, определения количества жизнеспособ-
ных микроорганизмов, хранения культур в коллекциях, для накопления
биомассы и др.
В целях уплотнения сред применяют агар, желатину или силикагель
(кремнекислый гель). Для уплотнения чаще всего используют агар. Он
представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входят ага-
роза и агаропектин. Агар получают из красных морских водорослей. Он
удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в ка-
честве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится
примерно при температуре 100 ºС и затвердевает при 40 ºС. Поэтому на
агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при отно-
сительно высокой температуре. Желатина – это экстракт, получаемый из
субстратов, богатых коллагеном – белком костей, хрящей, сухожилий,
чешуек. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 25 ºС,
которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганиз-
мов (30–37 ºС). Кроме того, желатина разжижается протеолитическими
ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти
свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняю-
щего средства. Силикагель используют как твердую основу для синтети-
ческих сред строго определенного состава.
Для жизнедеятельности микроорганизмов существенное значение
имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как
плотность среды, аэрация, температура, свет и влажность. Развитие мик-
роорганизмов возможно лишь в определенных диапазонах значения каж-
дого фактора, причем для различных групп микроорганизмов они часто
неодинаковы.
Так как рН среды имеет решающее значение для роста многих микро-
организмов, то в приготовленных средах всегда следует определять зна-
чение рН, которое может изменяться в процессе стерилизации. Поэтому
после стерилизации рН следует повторно проверить и, если это требует-
ся, установить нужное значение, стерильными растворами низкой кон-
центрации кислоты или щелочи. В процессе культивирования микроор-
ганизмов рН среды часто меняется и для того, чтобы не допустить чрез-
мерного изменения и удержать его на необходимом уровне, используют
различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы или
избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся ки-
слоты. Лучше всего контролировать рН среды в ферментерах, применяе-
мых для проточного культивирования.
Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному
кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования.
Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим
образом:
• на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, ко-
гда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха;
• в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае мик-
роорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низ-
кой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бакте-
рий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Наиболее про-
стой и широко распространенный в лабораторной практике способ глу-
бинного культивирования – выращивание на шейкерах (качалках), обес-
печивающих встряхивание колб или пробирок со скоростью
100–200 об/мин и более. Помимо перемешивания, аэрировать культуру
микроорганизмов можно продуванием под давлением через толщу среды
стерильного воздуха.
Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем
выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума
контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для этого ис-
пользуют различные приемы для создания анаэробных условий. Их под-
разделяют на физические, химические и биологические. Все они основа-
ны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом
пространстве.
К физическим методам создания анаэробных условий относится вы-
ращивание микроорганизмов в микроанаэростатах – вакуумных метал-
лических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может слу-
жить обычный стеклянный эксикатор с притертой крышкой. Из анаэро-
стата откачивают воздух, а затем заполняют его газовой смесью, состоя-
щей на 80–90 % из азота и на 10–20 % углекислого газа, до давления по-
рядка 500 мм рт. ст.
К химическим методам создания анаэробных условий относится ис-
пользование химических веществ, поглощающих кислород. В качестве
поглотителей кислорода в лабораторной практике применяется щелоч-
ной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое же-
лезо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реагенты. Погло-
тители помещают на дно химического эксикатора, в который помещают
анаэробные микроорганизмы, засеянные в пробирки, колбы или чашки
Петри. Эксикатор закрывают притертой крышкой. При этом способе соз-
дания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую спо-
собность используемых веществ и объем замкнутого пространства, в ко-
тором выращивается культура.
Биологический способ создания анаэробных условий заключается в
следующем. Питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на
две половины, на одну половину засевают облигатные аэробные бакте-
рии, а на другую облигатные анаэробные бактерии. Чашку закрывают,
зазор между донышком и крышкой заливают парафином или воском и
помещают в термостат с оптимальной для роста микроорганизмов тем-
пературой. Вначале наблюдается рост аэробных микроорганизмов (до
истощения свободного кислорода), после чего начинается размножение
клеток анаэробов.
Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие ме-
тоды, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:
• выращивание в высоком слое среды;
• выращивание в толще плотной среды;
• культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекуляр-
ного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости;
• заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового
масла или парафина.
Категория: Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки | Добавил: mig (24.12.2010)
Просмотров: 3925 | Рейтинг: 5.0/1
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Поиск
Друзья сайта
  • Здесь могла быть ваша реклама

  • Ставки на спорт
    Copyright MyCorp © 2016
    Конструктор сайтов - uCoz