Явление репарации (восстановления) жизнеспособности клеток после
действия на них γ- и рентгеновых лучей было открыто в 1949 г. в опытах
на дрожжах, а затем и на бактериях.
Если бактериальные клетки облучить УФ-светом, то они в основном
гибнут, так как УФ-лучи поглощаются ДНК с образованием в ней диме-
ров тимина, что приводит к частичному или полному блокированию ре-
пликации. Тем не менее выявлены три основных механизма репарации
ДНК после повреждений такого типа: фотореактивация, эксцизионная
репарация и пострепликационная, или рекомбинационная репарация.
Эксцизионную и пострепликационную репарации называют еще тем-
новой репарацией.
Фотореактивация – восстановление молекул ДНК, поврежденных
УФ-лучами, в результате последующего воздействия на них видимого
света. Бактериальные клетки содержат фермент фотореактивации – де-
зоксипиридинфотолиазу, синтез которого у бактерий E. coli детермини-
руется геном phr. Субстратом для этого фермента служат димеры тими-
на. Фермент находит в ДНК образовавшийся под действием УФ-лучей
пиримидиновый димер и прочно связывается с ним. Если клетки перене-
сти на видимый свет, то комплекс фермента фотореактивации и димеров
тимина распадается, при этом происходит восстановление нормальной
структуры ДНК, т. е. мономеризация или расщепление димеров тимина.
Следует отметить, что фотореактивация может работать как на дву-
нитевых, так и на однонитевых ДНК.
Системы эксцизионной репарации удаляют неправильно спаренные
или поврежденные основания из ДНК и затем синтезируют новую по-
следовательность ДНК, замещающую их.
Основной тип эксцизионной репарации, состоящей из нескольких
этапов, схематически изображен на рис. 74. На первом этапе узнавания
поврежденная структура распознается эндонуклеазой, которая разрезает
цепь ДНК на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5′-стороны и
четырех-пяти связей с 3′-стороны от повреждения. На стадии вырезания
5′–3′-экзонуклеаза удаляет поврежденный участок. Образующийся одно-
цепочечный участок служит в качестве матрицы для ДНК-полимеразы I
при синтезе цепи, замещающей вырезанную последовательность. Нако-
нец, ДНК-лигаза ковалентно связывает 3′-конец нового материала со
старым материалом.
Системы эксцизионной репарации включают у бактерий E. coli три
гена: uvrA, uvrB, uvrC. Эти гены кодируют компоненты репарационной
эндонуклеазы (uvrABC-эндонуклеазы).
Если повреждение в ДНК представляет собой структурное изменение
(например, образование в результате УФ-облучения димера тимина), то
поврежденные основания в процессе эксцизионной репарации удаляют-
ся, что ведет к восстановлению последовательности нуклеотидов, харак-
терной для ДНК дикого типа. Однако если нарушение заключается в не-
правильном спаривании оснований, возникающем в результате мутиро-
вания одного из них, репарирующая система не может определить, какое
именно основание представляет дикий тип, а какое – мутантный. Все это
узнается как два неправильно спаренных основания, каждое из которых
может служить объектом для эксцизионной репарации. Если вырезается
мутантное основание, то восстанавливается дикий тип последовательно-
сти. Если же случается, что вырезается исходное основание (дикого ти-
па), то новая (мутантная) последовательность закрепляется.
Клетки E. coli облученные ультрафиолетом, могут выжить с образо-
ванием жизнеспособного потомства даже в том случае, когда они не спо-
собны вырезать димеры тимина, т. е. когда у них не функционирует ме-
ханизм эксцизионной репарации ДНК. Из этого можно заключить, что
кроме механизма «иссечения и заполнения», в клетках должен существо-
вать другой механизм, спасающий от генетических повреждений. Как
показал П. Говард-Фландерс (1968), этот механизм заключается не в ис-
правлении повреждения в облученной ДНК, а в исправлении дефектной
дочерней ДНК, образующейся после репликации поврежденной роди-
тельской ДНК. В результате репликации поврежденной нити ДНК обра-
зуется ДНК-копия с однонитевыми пробелами или брешами напротив
димера тимина в родительской матричной цепи ДНК. Это говорит о том,
что наличие димера тимина в матричной нити ДНК препятствует про-
движению ДНК-полимеразы. Через 1 ч после синтеза таких разорванных
дочерних цепей эти бреши превращаются в непрерывные цепи ДНК
нормальной длины. Бреши в дочерних нитях заполняются за счет по-
стрепликационной репарации. Так как этот тип репарации не происхо-
дит в клетках, дефектных по рекомбинации (recА-мутантах), ее называют
также рекомбинационной репарацией.
Пострепликационная репарация происходит следующим образом.
При репликации дефектной (поврежденной) ДНК фермент ДНК-поли-
мераза останавливается перед димером тимина, а затем «перескакивает»
через этот димер и продолжает репликацию, оставив за собой пробел
(брешь) в дочерней цепи. Этот пробел заполняется в результате реком-
бинации со второй дочерней молекулой ДНК, образующейся при репли-
кации. Обмен цепями между молекулами ДНК осуществляет белок
RecA. Возникающий пробел на второй молекуле заполняется ДНК-поли-
меразой, считывающей комплементарную нить с матричной неповреж-
денной нити. Лигаза окончательно восстанавливает непрерывность цепи
Многие воздействия, которые повреждают ДНК или ингибируют ее
репликацию у бактерий E. coli, индуцируют серию фенотипических из-
менений, получивших название SOS-ответа. Начало такого ответа оп-
ределяется взаимодействием белка RecA с белком репрессором LexA.
Ответ клетки на повреждающее воздействие начинается с активации
протеазной активности белка RecA. Активирующим сигналом может
быть присутствие одноцепочечной области в сайте повреждения. Акти-
вируясь, RecA-про-теаза разрезает белок-репрессор LexA. Белок LexA
относительно стабилен в неповрежденных клетках, где он функциониру-
ет как репрессор многих оперонов, гены которых отвечают за различные
репарационные функции. Протеолитическое разрезание репрессора ко-
ординированно индуцирует все эти опероны. В настоящее время иден-
тифицировано 11 генов, которые участвуют в SOS-ответе в результате
активации их продуктов. Это пять генов din (от англ. damage inducible),
гены recA, lexA, uvrA, uvrB, umuC и himA. Некоторые из sos-генов актив-
ны только в поврежденных клетках; другие активны в необработанных,
но уровень их экспрессии увеличивается при разрезании белка LexA. Ус-
тановлено, что белок LexA репрессирует гены-мишени, связываясь с по-
следовательностью ДНК длиной около 20 пар оснований, названной
SOS-блоком. Эта последовательность симметрична, и ее копия пред-
ставлена в каждом локусе-мишени. Подобно другим операторам, SOS-
блоки перекрываются с соответствующими промоторами.
Белки RecA и LexA являются взаимными мишенями в SOS-цикле.
RecA разрезает LexA, который в свою очередь репрессирует RecA. SOS-
ответ вызывает амплификацию обоих белков.
При прекращении индуцирующего сигнала белок RecA теряет свою
протеазную активность. В этот момент ген lexA имеет высокий уровень
экспрессии; в отсутствие RecA-протеазы белки LexA быстро накаплива-
ются в неразрезанной форме и выключают sos-гены. Этим можно объяс-
нить обратимость SOS-ответа.
|