Явление рестрикции и модификации было подробно исследовано
В. Арбером в конце 1960-х годов при изучении развития бактериофага λ
в различных штаммах кишечной палочки.
Известно, что бактериофаги, как правило, проявляют специфичность
в отношении хозяев, т. е. они инфицируют ограниченное число родст-
венных штаммов, видов или родов бактерий. Это в первую очередь зави-
сит от того, имеются или нет на бактериальных клетках рецепторы для
адсорбции бактериофага. Кроме того, у бактерий есть и другие механиз-
мы, обусловливающие специфичность взаимоотношений с фагами. К
ним относятся системы рестрикции и модификации.
Рассмотрим функционирование этой системы на примере бактерио-
фага λ и клеток штамма E. coli K-12. Развитие фага приводит к эффек-
тивности посева, равной единице: каждая частица бактериофага заражает
бактериальную клетку, репродуцируется в ней и дает потомство, фикси-
руемое визуально по наличию на газоне чувствительных бактерий зон
лизиса или бляшек. Если фаголизатом, полученным после цикла разви-
тия фага λ на бактериях E. coli K-12, инфицировать бактерии E. coli
штамма C, то эффективность посева будет значительно ниже (10–4–10–5).
Следовательно, не каждая фаговая частица по каким-то причинам спо-
собна размножаться в клетках нового хозяина. Если же фаговые частицы,
образовавшиеся после цикла репродукции на клетках E. coli C, использо-
вать для заражения такой же культуры (E. coli C), то размножение бакте-
риофага λ вновь будет проходить нормально и эффективность посева со-
ставит единицу. Однако если перед заражением бактерий E. coli C фаг
пропассировать на клетках E. coli K-12, то на штамме E. coli C он будет
развиваться с низкой эффективностью.
Таким образом, при смене хозяина наблюдается значительное огра-
ничение размножения фага λ, которое получило название рестрикции.
Рестрикция обусловлена расщеплением инфицирующей ДНК фага под
действием фермента, специфичного для штамма-хозяина. Ферменты эти
получили название рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз. Бла-
годаря своему нуклеазному действию они препятствуют поддержанию
чужеродной ДНК в бактериальной клетке.
Если фаг проделал полный цикл репродукции в новом хозяине (в на-
шем примере штамм E. coli C), то в дальнейшем в этом же хозяине он не
подвергается ограничению, или рестрикции. Объяснить подобные факты
можно следующим образом. В бактериальной клетке, кроме рестриктаз,
синтезируются другие ферменты – метилазы, которые призваны защи-
щать собственную ДНК от действия клеточных рестриктаз. Метилазы
изменяют или модифицируют собственную ДНК путем метилирования
или гликозилирования аденина либо цитозина. Этот процесс известен
под названием модификации. ДНК бактериофага, прошедшего полный
цикл развития в новом хозяине, под действием метилаз модифицируется
таким же образом, как и ДНК клетки-хозяина.
Следовательно, работающая в клетках бактерий система рестрикции-
модификации (система R-M) образована двумя специфическими для оп-
ределенного штамма микроорганизма ферментами – ДНК-модифици-
рующим (аденин- или цитозинметилаза) и расщепляющим (рестриктаза).
Эти ферменты узнают в ДНК одни и те же определенные короткие по-
следовательности нуклеотидов – сайты. Метилаза, модифицируя опре-
деленные основания внутриклеточной ДНК, защищает ее от действия ре-
стриктазы, узнающей ту же нуклеотидную последовательность.
Системы рестрикции и модификации широко распространены среди
бактерий и найдены практически у всех исследованных видов. Недавно
рестриктазы обнаружены и у некоторых видов дрожжей. Из разных
штаммов микроорганизмов выделяют рестриктазы, различающиеся меж-
ду собой характером действия на ДНК.
В научной литературе рестриктазы обозначаются буквой R. Название
фермента складывается из первой буквы рода и двух первых букв вида
бактерий, из которого был выделен фермент, например Bacillus subtilis –
Bsu, Escherichia coli – Eco. Если же в определенном штамме имеется не-
сколько систем рестрикции и модификации, то вводится дополнительное
числовое обозначение. Ферменты систем рестрикции и модификации мо-
гут кодироваться плазмидными и фаговыми генами, и тогда к названию
фермента добавляется название внехромосомного элемента. Например,
название EcoR1 относится к ферменту рестриктазе, детерминируемому
плазмидой R1; название EcoP1 – к ферменту, кодируемому фагом Р1. В
настоящее время все известные рестриктазы в зависимости от потребно-
сти в кофакторах и характера расщепления нуклеотидных последова-
тельностей ДНК разделяют на три типа: I, II и III.
Рестриктазы I типа являются сложными белками с тремя различ-
ными типами субъединиц (эндонуклеаза, метилаза, фермент узнавания).
Для действия этих ферментов в качестве кофакторов требуются АТФ,
S-аденозинмонофосфат и ионы Mg2+. Расщепление ДНК совмещено с
гидролизом АТФ. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расще-
пляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта
узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеоти-
дов). В результате образуются самые разнообразные фрагменты ДНК,
или рестрикты. Такие рестриктазы невозможно использовать для реше-
ния генно-инженерных задач.
Системы рестрикции и модификации II типа представлены двумя от-
дельными белками (рестрикционная эндонуклеаза, модификационная
метилаза). Рестриктазы II типа – относительно просто организован-
ные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно
небольшой молекулярной массой. Для специфического действия этих
ферментов нужны только ионы Mg2+. Рестриктазы II типа характеризу-
ются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают.
Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность
ДНК и вызывает ее разрыв внутри этой последовательности. Сайты рест-
рикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте
на 180º последовательностями – палиндромами:
5′… GAATTC… 3′ _ Сайт рестрикции
3′…CTTAAG… 5′ Рестриктазы EcoR1
Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от
размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:
1) мелкощепящие – сайт рестрикции представлен 4 п.н.;
2) среднещепящие – сайт рестрикции – 6–8 п.н.;
3) крупнощепящие – сайт рестрикции – 10–14 п.н.
Рестриктазы II типа делятся на две группы в зависимости от того, ка-
ким образом они расщепляют последовательность ДНК. Одни из них
осуществляют прямой разрез ДНК (по оси симметрии). В результате об-
разуются фрагменты ДНК с тупыми или ровными концами. Примером
таких рестриктаз является эндонуклеаза BalI
Рестрикт Рестрикт
Рестриктазы, относящиеся ко второй группе, осуществляют ступен-
чатый разрез (на некотором расстоянии от оси симметрии). В результате
этого в месте разреза образуются неровные, или липкие, концы, т. е. ре-
стрикты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные
участки.
Рестрикты, полученные после воздействия на разные молекулы ДНК
определенной рестриктазы, имеют одинаковые липкие концы. Такие ре-
стрикты могут объединяться друг с другом с образованием рекомбинант-
ных молекул ДНК, что широко используется в генетической инженерии.
Рестриктазы III типа имеют некоторое сходство с рестриктазами I
типа. Фермент состоит из двух различных субъединиц (эндонуклеаза,
метилаза), и поэтому бифункционален, т. е. обладает как рестриктазной,
так и метилазной активностью. Для проявления эндонуклеазной актив-
ности требуются только АТФ и ионы Mg2+. Расщепление ДНК не сопро-
вождается гидролизом АТФ. Рестриктазы III типа гидролизуют ДНК на
расстоянии 20–39 п.н. от сайтов узнавания и поэтому также довольно
редко используются для практических целей.
Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах ак-
тивности. Это такое количество фермента, которое необходимо для пол-
ного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных услови-
ях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются
индивидуальными и зависят от рН, ионной силы раствора, присутствия
определенных ионов, температуры проведения реакции.
|