Методы выделения мутантов бактерий
Частота спонтанных мутаций для многих признаков бактерий очень
мала, и для того, чтобы выявить мутантные клетки, необходимо обследо-
вать или проверить от 104 до 1010 клеток. Повысить частоту мутаций
можно с помощью воздействия мутагенными факторами. Однако воз-
никновение мутаций даже в том случае, когда они вызываются сильными
мутагенами, – относительно редкое событие, и выделить или отобрать
мутант, присутствующий на обильном фоне немутировавших клеток, не-
легко. Все методы отбора мутантов подразделяются на две группы: ме-
тоды прямого отбора и методы непрямого отбора.
Методы прямого отбора предполагают высев популяции бактерий
на среду, содержащую тот или иной селектирующий агент. Прямым от-
бором можно выявить мутанты, устойчивые к различным антибиотикам,
бактериофагам или химическим ингибиторам, т. е. агентам, обладающим
в норме бактерицидным или бактериостатическим действием по отноше-
нию к немутировавшим родительским клеткам. Прямым отбором могут
быть выделены также мутанты, способные к утилизации нетрадицион-
ных источников углерода или азота. Благодаря высокой разрешающей
способности (т. е. способности выявлять немногочисленные мутантные
клетки на обильном фоне немутировавших) при использовании метода
прямого отбора обычно не возникает необходимости в каких-либо прие-
мах по обогащению культуры мутантами. Одна из основных трудностей
при прямом отборе состоит в выборе оптимальной концентрации селек-
тивного агента. Например, при отборе мутантов, устойчивых к различ-
ным антибиотикам, важно подобрать такую концентрацию антибиотика,
которая полностью блокировала бы рост бактерий дикого типа, но в то
же время позволяла бы развиваться устойчивым мутантам. Определение
оптимальной концентрации методом проб и ошибок может потребовать
много времени и сил. Для устранения этого разработаны более эффек-
тивные приемы селекции таких мутантов. Одним из них является селек-
ция мутантов на твердой питательной среде с градиентом концентрации
антибиотика (или какого-то другого ингибитора). Среды с градиентом
антибиотика готовят следующим образом: питательную агаризованную
среду заливают в чашку Петри, расположенную под углом к поверхности
лабораторного стола:
После затвердения среды чашку устанавливают горизонтально и по-
верх первого слоя наносят слой среды с антибиотиком в какой-то опре-
деленной концентрации:
С антибиотиком Без антибиотика
В результате диффузии антибиотика в нижний слой среды его кон-
центрация становится пропорциональной толщине слоя среды, и таким
образом устанавливается линейный градиент концентрации. Для того
чтобы выделить устойчивые мутанты, бактериальную суспензию (в кон-
центрации приблизительно 1·1010 кл/мл) высевают на верхний слой сре-
ды. Чашки помещают в термостат при оптимальной для роста бактерий
температуре. Образующаяся на чашке зона сплошного роста распростра-
няется до линии градиента в соответствии с допустимой, но неизвестной
концентрацией антибиотика. Вне этой зоны в местах, содержащих более
высокие концентрации ингибитора, можно обнаружить отдельные не-
многочисленные колонии.
Клоны, образованные клетками устойчивых мутантов, можно либо
повторно высеять штрихом по направлению к областям с более высокой
концентрацией антибиотика, либо использовать как исходный материал
для посева на другую среду с линейным градиентом концентрации анти-
биотика, причем в данном случае ингибитор берется в таком количестве,
чтобы его концентрация была в 2–5 раз выше, чем в первой чашке.
После отбора устойчивых к антибиотику мутантов нужно проверить
уровень устойчивости, т. е. определить ту максимальную концентрацию
антибиотика, к которой клетки являются устойчивыми. Это делают сле-
дующим образом: в чашки с различными концентрациями антибиотика в
агаризованной среде засевают отобранный или выделенный мутант. По-
сле инкубации при оптимальной для роста исследуемых бактерий темпе-
ратуре определяют концентрацию антибиотика, при которой еще наблю-
дается рост мутантных бактерий:
Контроль 10 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 200 мкг/мл
и т. д
(без антибиотика)
Кроме селекции устойчивых мутантов на средах с градиентом кон-
центрации ингибитора, используют и другие методы. Например, на по-
верхность агаризованной питательной среды в чашке Петри, засеянной
исследуемыми бактериями, помещают диск фильтровальной бумаги,
пропитанной раствором антибиотика или другим каким-то бактерицид-
ным агентом. Антибиотик диффундирует в среду, в результате чего кон-
центрация его линейно зависит от расстояния от диска. Рост бактерий
будет наблюдаться там, где концентрация антибиотика еще не ингибиру-
ет рост бактерий, вокруг диска может быть зона отсутствия роста бакте-
рий, в которой могут обнаруживаться отдельные колонии устойчивых
клеток:
Большинство типов мутантных клеток нельзя выявить методами пря-
мого отбора – это ауксотрофные мутанты, мутанты с измененной спо-
собностью к сбраживанию углеводов и некоторые условно-летальные
мутанты. Самым распространенным приемом непрямого выявления та-
ких мутантов являются случайный поиск соответствующих колоний и
метод перепечатывания колоний с одной чашки Петри на другую (метод
отпечатков, или реплик). Оба приема требуют проверки свойств большо-
го числа бактериальных колоний, что утомительно и требует больших
затрат времени.
Одним из способов повышения вероятности выявления нужного му-
танта является посев бактерий на среды, содержащие индикаторы. Суще-
ствуют методы, повышающие вероятность обнаружения нужных мутан-
тов. Например, для выявления мутантов бактерий кишечной группы с
измененной способностью к сбраживанию углеводов используют среду
ЕМВ, в состав которой входит соответствующий углевод и индикатор,
состоящий из эозина и метиленового синего. На этой среде колонии бак-
терий, сбраживающих углевод, окрашиваются в фиолетовый цвет с ме-
таллическим блеском, а колонии бактерий, не сбраживающих углевод, –
в светло-розовый цвет.
Часто для повышения вероятности выделения нужных мутантов ис-
пользуют пенициллиновый метод обогащения популяции бактерий му-
тантами. Этот метод был предложен в 1948 г. независимо Дж. Ледербер-
гом и Б. Дэвисом для обогащения популяции бактерий ауксотрофными
мутантами. Его можно применять по отношению ко всем видам бакте-
рий, чувствительным к пенициллину. Принцип метода основывается на
том, что пенициллин лизирует растущие бактерии, но не повреждает
бактерии, не способные к делению, например, такие, которые не раз-
множаются из-за отсутствия в среде определенного фактора роста. Если
смесь ауксотрофных и прототрофных бактерий инкубировать в мини-
мальной среде, содержащей летальную дозу пенициллина, то прото-
трофные клетки будут погибать, так как они способны к делению, тогда
как ауксотрофные мутанты, не способные к росту в этих условиях, вы-
живут и сохраняться, несмотря на присутствие в среде пенициллина. В
результате такой обработки доля ауксотрофных клеток в популяции рез-
ко увеличивается относительно общего числа клеток.
После обогащения популяции бактерий мутантными клетками их не-
обходимо изолировать. Для этого суспензию бактерий освобождают от
пенициллина путем центрифугирования и отмывания свежей средой или
добавлением пенициллиназы, а затем высевают на полноценную пита-
тельную среду. Сформировавшиеся колонии методом отпечатков прове-
ряют на способность к росту на минимальной среде. Клетки клонов, ко-
торые растут на полноценной среде, но не растут на минимальной, и яв-
ляются ауксотрофными мутантами.
Если бактерии устойчивы к пенициллину, то для обогащения можно
применить другие антибиотики (новобиоцин, циклосерин, канамицин,
налидиксовую кислоту и др.).
С помощью подобных приемов можно обогащать популяцию бакте-
рий не только ауксотрофными мутантами, но и мутантами других типов,
например температуроустойчивыми (при этом антибиотик вызывает ги-
бель клеток дикого типа, растущих при более высокой температуре), не-
способными использовать определенный субстрат и др.
|