Генетические критерии систематики - Глава 3. Основы генетики - Каталог статей - Общая биология 10-11 классы
Главная | Регистрация | Вход | RSSСреда, 07.12.2016, 19:18

Биология 10-11 класс

Меню сайта
Категории раздела
Введение [30]
Глава1.Основы цитологии [16]
Глава 2.Размножение и индивидуальное развитие организмов [14]
Глава 3. Основы генетики [16]
Глава 4. Генетика человека [12]
Глава 5.Основы учения об эволюции [11]
Глава 6. Основы селекции и биотехнологии [10]
Глава 7. Антропогенез [11]
Глава 8. Основы экологии [10]
Глава 9. Эволюция биосферы и человек [11]
Биологический словарь на букву "А" [54]
Биологический словарь на букву "Б" [56]
Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки [49]
Глава 11.О чем умолчали учебники [36]
7 [18]
Категории раздела
Введение [30]
Глава1.Основы цитологии [16]
Глава 2.Размножение и индивидуальное развитие организмов [14]
Глава 3. Основы генетики [16]
Глава 4. Генетика человека [12]
Глава 5.Основы учения об эволюции [11]
Глава 6. Основы селекции и биотехнологии [10]
Глава 7. Антропогенез [11]
Глава 8. Основы экологии [10]
Глава 9. Эволюция биосферы и человек [11]
Биологический словарь на букву "А" [54]
Биологический словарь на букву "Б" [56]
Глава 10.Морфология и структурная организация бактериальной клетки [49]
Глава 11.О чем умолчали учебники [36]
7 [18]
Наш опрос
Оцените мой сайт
Всего ответов: 40
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Форма входа

Каталог статей

Главная » Статьи » Глава 3. Основы генетики

Генетические критерии систематики
1.2. Генетические критерии систематики
Наиболее объективными и дающими представление о филогенетиче-
ских связях между микроорганизмами являются генетические (молеку-
лярно-биологические) критерии. К ним относятся определение относи-
тельного содержания ГЦ-пар в ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот,
определение нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК или
РНК, применение генетических зондов (ДНК-зондов), рестрикционный
анализ ДНК, методы генетического анализа (изучение переноса генов,
генетических скрещиваний, картирование хромосом бактерий и др.).
Относительное содержание ГЦ-пар в ДНК представляет собой
стабильный признак бактерий, не зависящий ни от возраста, ни от усло-
вий культивирования, ни от отдельных перестроек генов в хромосоме
(т. е. данное свойство практически не изменяется под влиянием боль-
шинства мутаций).
Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличаются друг от друга
относительным содержанием пуриновых и пиримидиновых оснований,
которые формируют комплементарные пары в антипараллельных цепях
ДНК. Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или сход-
ное содержание ГЦ-пар в ДНК, а далеко отстоящие в генетическом от-
ношении сильно отличаются по относительному содержанию этих азо-
тистых оснований. Молярное содержание ГЦ-оснований у широкого
круга прокариот колеблется в широких пределах: от 25 до 80 мол. %. В
то же время, например у разных видов бактерий рода Pseudomonas, со-
держание ГЦ-пар в ДНК имеет близкие величины – от 61,8 до 69,5 мол.
% от общего количества оснований. Следовательно, каждый вид бакте-
рий имеет ДНК с характерным средним содержанием ГЦ-пар, и эту ве-
личину можно рассматривать как один из важных признаков вида.
Нуклеотидный состав ДНК бактерий можно определить химически-
ми и физическими методами.
К химическим относится метод хроматографии на бумаге. Определе-
ние состава ДНК этим методом включает следующие основные этапы:
выделение ДНК, ее гидролиз до азотистых оснований, разделение их с
помощью хроматографии на бумаге, элюирование оснований с бумаги и
последующая ультрафиолетовая спектрофотометрия. Хотя этот метод
довольно длителен и трудоемок, он позволяет определить непосредст-
венное соотношение азотистых оснований в ДНК, в то время как в дру-
гих методах расчеты содержания ГЦ- или АТ-пар основаны на косвен-
ных данных. Метод хроматографии на бумаге является классическим ме-
тодом определения нуклеотидного состава ДНК, в сравнении с которым
можно выявить точность и корректность использования других.
К физическим относятся метод определения содержания азотистых
оснований по температуре плавления ДНК и метод ультрацентрифугиро-
вания ДНК в градиенте плотности хлорида цезия.
Установлено, что существует прямая зависимость между содержани-
ем ГЦ-пар в молекуле ДНК и температурой ее плавления. Температура
плавления – это температура, при которой происходит денатурация ДНК
в результате разрыва водородных связей между азотистыми основания-
ми. Поскольку число водородных связей между гуанином и цитозином
больше (3), чем между основаниями в АТ-парах (2), то чем выше содер-
жание ГЦ-пар в ДНК, тем выше температура ее плавления. Следователь-
но, температура плавления любой ДНК служит показателем ее нуклео-
тидного состава.
Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптиче-
ской плотности при 260 нм, т. е. максимуме поглощения ДНК в УФ-све-
те, что легко измерить спектрофотометрически. При постепенном нагре-
вании образца ДНК поглощение увеличивается по мере разрыва водо-
родных связей и достигает плато при температуре, когда ДНК становит-
ся полностью одноцепочечной
Метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлори-
да цезия (CsCl) основан на том, что имеется линейная зависимость меж-
ду плотностью ДНК и содержанием в ней ГЦ-пар. Препарат ДНК добав-
ляют к концентрированному раствору CsCl и центрифугируют в течение
24 ч. Установившееся за это время распределение ДНК в градиенте CsCl
зависит от ее плотности. При определении нуклеотидного состава ДНК
по градиенту плотности в CsCl в качестве стандарта используют ДНК с
заведомо известной плотностью. Применение этого метода ограничено
из-за сложности оборудования.
Существуют и другие методы определения нуклеотидного состава
ДНК (при помощи бромирования оснований, депуринизации, спектраль-
ного анализа, электрофореза в полиакриламидном геле и др.), но они не
нашли широкого применения в основном из-за высокой требовательно-
сти к качеству исследуемых препаратов ДНК и недостаточной точности.
Более тонким методом оценки генетического сходства организмов
является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с
помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных
участков в геномах сравниваемых видов. Главным достоинством этого
метода является то, что он впервые позволил провести количественную
оценку родства микроорганизмов. В основе метода лежит способность
денатурированных (одноцепочечных) ДНК в подходящих условиях реас-
социировать, т. е. соединяться с образованием двухцепочечных молекул
ДНК. Для этого ДНК, выделенную из клеток одного микроорганизма,
денатурируют нагреванием. Клетки другого штамма выращивают в сре-
де, содержащей радиоактивный предшественник ДНК (3Н, 14С), в резуль-
тате включения которого ДНК становится меченой. Из клеток этого
штамма выделяют ДНК, денатурируют ее и смешивают с денатуриро-
ванной ДНК первого штамма. Раствор выдерживают при температуре
ниже температуры плавления ДНК. При этом происходит «отжиг», или
специфическая реассоциация комплементарных цепей с образованием
двухцепочечных гибридных молекул ДНК. Оставшиеся после «отжига»
одноцепочечные ДНК удаляют обработкой ДНКазой. Гибридные моле-
кулы можно обнаружить путем центрифугирования препарата в градиен-
те CsCl, где они образуют полосы, занимающие промежуточное положе-
ние между «легкими» и «мечеными» молекулами двуспиральной ДНК.
При аналогичных экспериментах с препаратами ДНК из двух нерод-
ственных бактерий никакой гибридизации не выявляется; после «отжи-
га» двойные спирали образуются при специфическом спаривании только
тех цепей, которые первоначально были получены из одной и той же мо-
лекулы ДНК.
Однако оценка гомологии на основе метода центрифугирования в
градиенте плотности слишком громоздка для повседневного использова-
ния и, кроме того, позволяет обнаружить реассоциацию только тех ком-
плементарных цепей, которые обладают очень высокой степенью сход-
ства. Для измерения реассоциации молекул нуклеиновых кислот был
разработан ряд более простых методов. Все они основаны на том, что
образование двойных спиралей ДНК должно происходить при использо-
вании двух разных образцов денатурированной ДНК, один из которых
помечен радиоактивным изотопом; необходимо лишь отделение двой-
ных спиралей от остаточной одноцепочечной нуклеиновой кислоты и
измерение радиоактивности двойных спиралей.
Простейший повсеместно используемый способ изучения реассоциа-
ции нуклеиновых кислот – метод с применением колонки, содержащей
гидроксилапатит. Гидроксилапатит представляет собой гель фосфата
кальция, который при определенных условиях специфически адсорбиру-
ет только двойные, но не одиночные цепи нуклеиновых кислот. Гибри-
дизационную смесь пропускают через колонку, которую затем промы-
вают для удаления из нее одноцепочечных молекул. Адсорбированные
двойные спирали элюируют, и в элюате определяют радиоактивность.
Для этого метода необходимо присутствие очень большого избытка не-
меченой ДНК (в несколько тысяч раз превышающего количество мече-
ной ДНК), чтобы предотвратить реассоциацию меченых комплементар-
ных цепей.
В экспериментах по реассоциации любого типа должны быть стан-
дартизированы температурные условия, ионная сила раствора и средняя
длина фрагментов ДНК, так как все эти факторы влияют на возможность
образования двойных спиралей.
Следует отметить, что метод молекулярной гибридизации ДНК не
всегда может быть использован для изучения родственных связей между
эволюционно далекими группами бактерий. Существует определенный
уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей ДНК, ниже ко-
торого образования гибридных молекул не происходит. В таком случае
изучают реассоциации ДНК–рРНК. Этот метод позволяет значительно
расширить список организмов, у которых можно выявить генетическую
гомологию благодаря тому, что на относительно небольшом участке бак-
териального генома, кодирующего рибосомные РНК, исходная последо-
вательность оснований является более консервативной и сохраняется
значительно полнее, чем в основной массе хромосомной ДНК. В итоге
путем реассоциации ДНК–рРНК часто можно обнаружить довольно вы-
сокую гомологию геномов двух бактерий, у которых реассоциация
ДНК–ДНК не выявляет заметной гомологии.
Как уже отмечалось, сравнивать генотипы бактерий можно с помо-
щью методов генетического анализа. Известно, что перенос генетиче-
ской информации и рекомбинация ее с ДНК реципиента может происхо-
дить только между двумя родственными организмами. Осуществлению
межвидового, межродового переноса генов могут препятствовать внеш-
ние барьеры, например различия в строении поверхностных структур
клеток, что ограничивает конъюгацию или необходимое для трансдук-
ции прикрепление бактериофага. Таким же препятствием является фер-
ментативное расщепление «чужой» ДНК после ее проникновения в клет-
ку в результате рестрикции со стороны хозяина. Образование генетиче-
ских рекомбинантов служит значительно более точным показателем
уровня генетической гомологии, чем гибридизация in vitro, поскольку
включение каждого отдельного фрагмента молекулы ДНК донора зави-
сит от степени его гомологии с ДНК реципиента именно в том неболь-
шом специфическом участке хромосомы, в котором должна произойти
рекомбинация.
В последние годы в таксономических исследованиях нашел приме-
нение такой метод изучения строения генома бактерий, как рестрикци-
онное картирование. Ферменты рестриктазы способны распознавать
специфические нуклеотидные последовательности и в строго определен-
ных участках (сайтах рестрикции) «разрезать» молекулы ДНК на фраг-
менты (рестрикты). Расположение фрагментов ДНК, продуктов расщеп-
ления, разделенных с помощью электрофореза в агарозном геле, дает
существенную информацию о типе и количестве специфических нуклео-
тидных последовательностей в хромосомах изучаемых организмов и по-
зволяет судить об их сходстве или различии. Этот метод привлекателен в
силу того, что дает возможность выявить сравнительно тонкие различия
в последовательностях нуклеотидов ДНК и поэтому его можно исполь-
зовать для дифференциации микроорганизмов на внутривидовом уровне.
Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов) основан на
реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последователь-
ности (зондом), несущим наиболее специфический и консервативный
для данного вида бактерий ген, с полимерной ДНК изучаемого микроор-
ганизма. С помощью этого метода можно идентифицировать любой био-
логический объект. Точность метода зависит от используемого зонда
(его «чистоты»). Наилучшими ДНК-зондами являются полученные пу-
тем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности, рас-
положение нуклеотидов в которых соответствует таковому в участке ге-
на (или всего гена), ответственного за определенную функцию бактерий.
ДНК-зонды метят различными способами, например флуоресцентными
красителями, радиоизотопами или биотином. Разрешающая способность
метода может быть значительно повышена с помощью цепной ДНК-
полимеразной реакции. В основе полимеразной цепной реакции (ПЦР)
лежит многократное реплицирование специфического участка нуклео-
тидной последовательности, катализируемое ДНК-зависимой ДНК-
полимеразой, и использование праймера (от англ. primer – запал, средст-
во воспламенения) – фрагмента ДНК, несущего наиболее специфичную
для данного микроорганизма нуклеотидную последовательность гена
(или участка гена). С помощью праймера обнаруживают искомый фраг-
мент идентифицируемого микроорганизма. Чувствительность метода ис-
ключительно высока и за несколько часов он позволяет увеличить число
копий исследуемого фрагмента ДНК в 106–108 раз. ПЦР может быть ис-
пользована для идентификации ДНК любого микроорганизма, если для
него имеется соответствующий праймер. Применение ПЦР особенно по-
казано в тех случаях, когда трудно выделить чистую культуру возбуди-
теля какого-либо заболевания из-за сложности методов культивирования,
малого количества возбудителя в исследуемом образце, высокой анти-
генной изменчивости и т. д. ПЦР незаменима для обнаружения во внеш-
ней среде так называемых некультивируемых, но жизнеспособных форм
бактерий, в том числе патогенных (холерного вибриона, сальмонелл, ле-
гионелл и др.). Тест-системы с праймерами для проведения ПЦР в целях
обнаружения возбудителей различных заболеваний разработаны и вне-
дряются в практику.
Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирова-
ние) дает возможность проводить сопоставительный анализ последова-
тельностей в различных молекулах ДНК и РНК. Поскольку секвенирова-
ние всего генома бактерий в настоящее время – трудоемкая и дорого-
стоящая процедура, то чаще всего анализируются нуклеотидные после-
довательности рибосомных РНК – 16S-рРНК. Эта РНК универсально
распространена, функционально постоянна и, кроме того, достаточно
консервативна, чтобы установить глубокие эволюционные связи. Чем
больше различий в последовательности нуклеотидов 16S-рРНК у двух
бактерий, тем раньше началось расхождение между ними и, следова-
тельно, тем дальше отстоят они друг от друга в филогенетических отно-
шениях.
Категория: Глава 3. Основы генетики | Добавил: mig (17.12.2010)
Просмотров: 1444 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Поиск
Друзья сайта
  • Здесь могла быть ваша реклама

  • Ставки на спорт
    Copyright MyCorp © 2016
    Конструктор сайтов - uCoz