Генетический материал прокариот представлен молекулой (молеку-
лами) ДНК, уложенной в компактную структуру и локализованной в ог-
раниченных участках цитоплазмы, не имеющей, в отличие от эукариот,
собственной ядерной мембраны. Учитывая эти особенности, генетиче-
ский аппарат прокариот принято называть нуклеоидом.
Тот факт, что в состав нуклеоида входит ДНК, впервые удалось пока-
зать Ж. Кейрнсу с помощью метода радиоавтографии. Для этого бакте-
рии E. coli выращивали на среде, содержащей предшественник тимина
тимидин, меченный тритием (3Н). Известно, что ДНК – единственное
вещество в клетке, которое содержит тимин. Если клетки бактерий,
включившие тритий в тимин, лизировать с помощью лизоцима на мем-
бранном фильтре, то можно получить радиоавтограф развернутой моле-
кулы бактериальной ДНК. Такие радиоавтографы убедительно доказы-
вают, что ДНК бактерий E. coli имеет форму нити, замкнутой в кольцо.
Эта замкнутая в кольцо молекула ДНК включает несколько тысяч генов,
расположенных линейно, и называется хромосомой.
В зависимости от метода микроскопирования и фиксации нуклеоид
выглядит по-разному. При применении световой микроскопии и фикси-
ровании парами тетраоксида осмия или использовании различных вари-
антов окрашивания по Романовскому–Гимза нуклеоид выглядит как бо-
бовидное тело с хорошо очерченными контурами, занимающее цен-
тральную часть бактериальной клетки, и длиной (у бактерий кишечной
группы) около 1 мкм. В фазово-контрастном микроскопе в клетках жи-
вых бактерий нуклеоид также выглядит как овальное тельце, светлое на
фоне темной цитоплазмы. При микроскопировании ультратонких срезов
бактерий в электронном микроскопе нуклеоид напоминает клубок мот-
ков толстой веревки, состоящей из множества нитей. Используя тот же
способ микроскопирования и иммуноокрашивание срезов замороженных
бактерий, можно рассмотреть нуклеоид в виде кораллоподобной струк-
туры с плотной сердцевиной и тонкими рогами- выступами. Выступы,
или ветви, пронизывают цитоплазму и образуют нечто вреде ореола во-
круг сердцевины.
Полностью «уложенный» нуклеоид представляет собой достаточно
компактное образование. Стабилизирующую роль в такой организации
играют специфические белки. У бактерий кишечной группы известно по
меньшей мере пять белков – HU, INF, H1, HLP1 и H, которые способст-
вуют «упаковке» ДНК. Они сходны по аминокислотному составу и дру-
гим свойствам с гистонами эукариот, имеют сравнительно небольшие
размеры (9–28 кД) и в большинстве своем относятся к основным. Похо-
жие белки, которые способствуют «упаковке» ДНК, выделены у самых
различных микроорганизмов, в том числе и архебактерий. Наибольшее
значение в «упаковке» ДНК играет белок HU. Связываясь с ДНК, он ме-
няет конформацию ее витков.
Важную роль как для сохранения целостности структуры, так и для
функционирования генома бактерий играет прикрепление нуклеоида к
цитоплазматической мембране. При щадящих способах нуклеоиды вы-
деляются вместе с «фрагментами» мембраны. С использованием различ-
ных методов было показано, что имеются фиксированные точки прикре-
пления нуклеоида к мембране: точка начала репликации и точка завер-
шения репликации. Кроме того, нуклеоид имеет «скользящие участки»
прикрепления к мембране, в частности тот участок, в котором в данный
момент идет репликация, и большое количество «неспецифических» то-
чек контакта с мембраной.
Хотя каждая бактериальная клетка у большинства видов бактерий со-
держит одну хромосому (большинство бактерий – гаплоидные организ-
мы), часто в интенсивно растущей культуре количество ДНК на клетку
может достигать массы, равной 3, 4, 8 и более хромосом. Из этого следу-
ет, что термины «нуклеоид» и «хромосома» не всегда совпадают. В зави-
симости от условий нуклеоид бактериальной клетки может состоять из
одной или нескольких копий одной и той же хромосомы. Так, у Azotobacter
chroococcum в экспоненциальной фазе роста (наиболее интенсивного
роста и размножения) на одну клетку приходится 20–25 копий хромосо-
мы, у Desulfovibrio gigas – 9–17 копий хромосомы.
Размеры хромосомной ДНК у различных видов бактерий отличаются
друг от друга. В качестве примера можно привести размеры хромосом-
ной ДНК некоторых бактерий. У одной из наименьших по размеру бак-
терий Mycoplasma genitalium, вызывающей у людей уретриты, хромо-
сомная ДНК равна 580.070 п. н.; у бактерий E. coli – 4.653.831 п. н. Нить
хромосомной ДНК у бактерий E. coli имеет линейный размер в 1,6 мм, а
длина упакованного нуклеоида – 1 мкм, что короче хромосомы в 1600
раз.
Уже отмечалось, что большинство бактерий – гаплоидные организмы,
т. е. они имеют одну хромосому. Однако у различных видов бруцелл,
Rhodobacter sphaeroides, Agrobacterium tumefaciens, Leptospira interrogans
клетки имеют по две хромосомы, различающиеся между собой по вели-
чине. У Burkholderia cepacia имеются даже три хромосомы. Эти данные
были получены посредством пульс-фореза, позволяющего разделить по
подвижности в геле очень крупные молекулы ДНК.
Сравнительно недавно считалось, что хромосомная ДНК бактериаль-
ной клетки, как правило, замкнута в кольцо, что доказывалось с помо-
щью метода радиоавтографии. Кроме того, о кольцевой структуре хро-
мосомы у E. coli, Salmonella typhimurium и Bacillus subtilis свидетельст-
вуют и данные генетического анализа: были построены кольцевые гене-
тические карты без каких-либо промежутков между группами сцепления.
Наконец, физические карты хромосом, построенные с использованием
ферментов рестриктаз, разрезающих хромосому в участках специфиче-
ских нуклеотидных последовательностей, также свидетельствовали о
кольцевой организации хромосом. Такие хромосомы в силу своей струк-
туры не могли быть разделены в геле при пульс-форезе. Однако в 1989 г.
была опубликована статья о необычном поведении при пульс-форезе
хромосомы Borrelia burgdorferi – возбудителя клещевого спирохетоза.
Эта ДНК входила в гель и двигалась в нем точно так же, как заведомо
линейные хромосомы дрожжей, взятые в качестве контроля. Оказалось,
что терминальные участки ДНК линейной хромосомы у боррелий закан-
чивались шпилечными структурами. У других спирохет (лептоспир и
трепонем) хромосома была кольцевой.
Позже появились данные о том, что после обработки протеазами вы-
деленная из клеток кольцевая ДНК ряда видов актиномицетов превраща-
ется в линейную. Это было неожиданным, так как для актиномицетов
уже существовали физические кольцевые карты. Однако выяснилось, что
хромосомы актиномицетов оказались «псевдокольцевыми»: они были
замкнуты не за счет непрерывного перехода цепочки ДНК правого полу-
кружия хромосомы в левое, а за счет взаимодействия белковых молекул,
расположенных на свободных концах ДНК линейной хромосомы и за-
мыкающих их, протеазы же разрывают эту связь. Таким образом, у акти-
номицетов оказался другой, чем у боррелий, тип организации хромосом.
Линейная хромосома была обнаружена и у фитопатогенных бактерий
Rhodococcus fascians.
Считается, что теоретически возможны три механизма репликации
ДНК
1. Консервативный, при котором сохраняется целостность всей ро-
дительской двойной спирали (не происходит раскручивания спирали), и
она является матрицей для синтеза себе подобной. Дочерняя двойная
спираль полностью образуется из нового материала, а родительская как
таковая сохраняется.
2. Дисперсивный, в соответствии с которым родительская молекула
ДНК распадается на фрагменты, а синтез новых цепей происходит на
фрагментах, которые затем крест-накрест объединяются с отрезками но-
вого материала. Каждая полинуклеотидная цепь в этом случае должна
была бы состоять из чередующихся отрезков старого и нового материала.
3. Полуконсервативный предполагает, что родительская двойная
спираль раскручивается, и каждая полинуклеотидная цепь служит матри-
цей для синтеза новой комплементарной цепи. Таким образом, новая
двойная молекула оказывается «гибридом» старой и вновь синтезиро-
ванной цепи.
В 1957 г. М. Меселсон и Ф. Сталь экспериментально доказали, что
репликация хромосомной ДНК у бактерий происходит по полуконсерва-
тивному механизму. Для доказательства этого бактерии E. coli выращи-
вали на среде в присутствии хлорида аммония, содержащего тяжелый
изотоп азота (15N). Через некоторое время бактерии переносили на среду
с легким азотом (14N). До и после пересева через определенные проме-
жутки времени отбирали пробы бактерий, лизировали их, из клеток вы-
деляли ДНК и определяли ее плотность методом равновесного центри-
фугирования в градиенте плотности хлорида цезия. Параллельно бакте-
рии выращивали в присутствии только легких или только тяжелых изо-
топов азота и проводили те же процедуры, что и с опытными культурами
E. coli.
Оказалось, что препараты ДНК, выделенные из бактерий, выращен-
ных на средах с разными изотопными формами азота, отличаются по
плотности. ДНК, выделенная из бактерий, выращенных на среде с 15N,
более тяжелая, чем ДНК бактерий, выращенных на среде с 14N. Однако
ДНК, выделенная из бактерий, первоначально растущих на среде с 15N, а
затем перенесенных на среду с 14N, имела промежуточную плотность,
т. е. была «полутяжелой», или «гибридной». Общее количество такой
«полутяжелой» ДНК оставалось постоянным на протяжении нескольких
поколений (генераций), тогда как количество «легкой» ДНК увеличи-
лось. М. Меселсон и Ф. Сталь сделали вывод, что в молекуле «полутяже-
лой» ДНК в составе пуриновых и пиримидиновых оснований одна цепь
содержит 15N, а вторая – 14N.
Результаты этих экспериментов не объясняются ни консервативным,
ни дисперсивным механизмом репликации ДНК, так как при консерва-
тивном механизме выявились бы только полосы тяжелой и легкой ДНК,
а при дисперсивном – только полосы гибридной ДНК (и после несколь-
ких генераций). Для доказательства того, что «полутяжелая» ДНК состо-
ит из одной нити, содержащей 15N, и одной нити, содержащей 14N, ее
подвергали «плавлению» (нагревали до 100 ºС и быстро охлаждали) для
получения одноцепочечных ДНК. Препарат ДНК центрифугировали в
градиенте плотности хлорида цезия, после чего были выявлены две по-
лосы: типичная для одноцепочечной ДНК с 14N и типичная для такой же
ДНК с 15N. Таким образом, М. Меселсон и Ф. Сталь доказали, что репли-
кация хромосомной ДНК у бактерий осуществляется по полуконсерва-
тивному механизму.
Молекулярные механизмы репликации бактериальной ДНК сходны в
общих чертах с таковыми у других организмов. Для того чтобы про-
изошла репликация ДНК по полуконсервативному механизму, необхо-
димо, чтобы двухцепочечная молекула ДНК расплелась с образованием
одноцепочечных фрагментов. В этом процессе участвует несколько фер-
ментов, основными из них являются:
1) ДНК-геликазы, перемещающиеся по цепи ДНК в направлении
5′ → 3′ и перемещающиеся в направлении 3′ → 5′;
2) SSB-белки (single strand binding – связывающиеся с однонитевой
ДНК), которые связываются с однонитевой ДНК и препятствуют ее ре-
натурации;
3) ДНК-гиразы, или топоизомеразы, белки, которые снимают напря-
жение при раскручивании кольцевых молекул ДНК и способствуют ее
расплетанию.
На образовавшихся однонитевых участках ДНК идет синтез компле-
ментарных цепей. В этом процессе участвуют ферменты ДНК-полимера-
зы. У бактерий E. coli синтезируются три типа ДНК-полимераз (I, II и
III). Главную роль в репликации хромосомной ДНК у бактерий E. coli
играет ДНК-полимераза III.
Доказано, что синтез ДНК протекает только в направлении от 5′ к
3′-ОН концу . Однако цепи ДНК противоположно направлены и
поэтому синтез одной из дочерних цепей осуществляется непрерывно с
помощью ДНК-полимеразы III в направлении 5′ → 3′. ДНК-полимераза
III перемещается по цепи 3′ → 5′ в направлении раскрывания репли-
кативной вилки и синтезирует новую цепь. Эта цепь называется веду-
щей, или лидирующей.
Копия второй цепи (5′ → 3′) называется запаздывающей и она синте-
зируется из фрагментов ДНК размером 1000–2000 нуклеотидов, которые
называются фрагментами Оказаки. Для синтеза фрагментов Оказаки
необходима «затравка», или праймер. В качестве затравки выступает ко-
роткая цепь РНК, которая синтезируется с помощью ДНК-зависимой
РНК-полимеразы на матрице ДНК. К этой затравке ДНК-по-лимераза III
присоединяет дезоксирибонуклеотиды, в результате образуются фраг-
менты Оказаки. РНК-праймеры удаляются за счет активности ДНК-по-
лимеразы I, после чего игаза сшивает отдельные фрагменты Оказаки
друг с другом и целостность новой цепи восстанавливается.
Репликация всего кольца ДНК может происходить как в одном, так и
в двух противоположных направлениях двойной спирали, что соответст-
венно предполагает наличие одной или двух репликативных вилок на
одной молекуле ДНК.
Процесс репликации тесно связан с ростом и делением бактериальной
клетки. Обычно деление бактериальной клетки по времени осуществля-
ется после завершения цикла репликации молекулы ДНК. Однако в ин-
тенсивно растущих культурах репликация ДНК может опережать деле-
ние клетки и нередко в ней содержится ДНК в 4–8 раз больше, чем масса
одной хромосомы. Время удвоения хромосомы бактерий E. coli занимает
приблизительно 40 мин. Однако в благоприятных условиях деление кле-
ток происходит за 20 мин. Это значит, что новый цикл репликации до-
черних хромосом начинается еще до того, как заканчивается предыду-
щий.
Уже отмечалось, что между бактериальной ДНК и цитоплазматичес-
кой мембраной существует физическая связь; бактериальную ДНК мож-
но обнаружить в мембранных фракциях после центрифугирования кле-
точных лизатов, а также с помощью электронной микроскопии удалось
визуализировать места прикрепления хромосомы к впячиваниям мем-
браны (мезосомам).
Связь бактериальной хромосомы или плазмиды с цитоплазматиче-
ской мембраной играет существенную роль в регуляции их репликации.
Существуют две модели, объясняющие регуляцию репликации бактери-
альной ДНК. Согласно модели, предложенной Ф. Жакобом, С. Бренне-
ром и Ф. Кьюзеном (1963), структура, способная самостоятельно репли-
цироваться, называется репликоном: это относится к хромосомам и
плазмидам бактерий. Репликон должен иметь кольцевую форму и репли-
цироваться не по частям, а как единое целое. Согласно этой модели, реп-
ликон должен быть прикреплен к цитоплазматической мембране и обяза-
тельно обладать двумя специфическими детерминантами или генами –
структурным геном и геном-репликатором (или оператором реплика-
ции). При росте клетки от мембраны поступает сигнал на структурный
ген и активирует его. Происходит синтез специфического белка-инициа-
тора, который действует на ген-репликатор, что приводит к началу про-
цесса репликации, который продолжается вдоль всего репликона и за-
канчивается копированием всей его структуры. После репликации ДНК
поступает обратный сигнал на мембрану, инициируя деление клетки.
Данная модель получила название модели позитивной регуляции реп-
ликации.
Кроме того, существует модель негативной регуляции репликации
(Р. Притчард, П. Барт, Дж. Коллинз, 1969). В соответствии с этой моде-
лью в составе репликона есть ген, отвечающий за синтез белка-репрес-
сора, который при высокой концентрации негативно действует на ини-
циацию репликации, а в малой концентрации не влияет на этот процесс.
По мере роста клетки концентрация репрессора снижается и создается
возможность репликации хромосомы или плазмиды.
|