Генетическая инженерия – совокупность методов, позволяющих
создавать in vitro рекомбинантные молекулы ДНК, с последующим вве-
дением этих новых генетических структур в живую клетку.
Так как с химической точки зрения ДНК всех организмов однотипна,
то in vitro возможно воссоединение фрагментов ДНК из любых организ-
мов. В этом смысле рекомбинация in vitro отличается от обычной гене-
тической рекомбинации, которая требует гомологии ДНК и, как правило,
осуществляется в пределах одного или близкородственных видов. Дру-
гими словами, обычные методы обмена генетической информацией
(конъюгация, трансдукция, трансформация) позволяют провести обмен
генами внутри одного вида, тогда как генетическая инженерия, в прин-
ципе, открывает возможность, для перемещения генов в пределах всех
живых организмов.
Для того чтобы осуществить генно-инженерный эксперимент, т. е.
создать рекомбинантную ДНК и ввести ее в клетку другого организма,
необходимо соблюсти следующие условия:
• иметь инструменты для разрезания молекул ДНК на фрагменты;
• иметь инструменты для соединения фрагментов ДНК, выделенных
из различных источников;
• подобрать переносчик, или вектор генов, предназначенных к введе-
нию в клетку другого организма. Этот вектор должен самостоятельно
реплицироваться в клетке и обеспечивать репликацию введенного фраг-
мента ДНК;
• разработать способ введения гибридных или рекомбинантных мо-
лекул ДНК в живую клетку;
• определить метод отбора (селекции) клона реципиентной клетки,
воспринявшей гибридную молекулу ДНК.
Самыми удобными векторами являются плазмиды, так как они, во-
первых, способны реплицироваться независимо от хромосомной ДНК
бактерий. Во-вторых, плазмиды содержат гены, благодаря которым по
фенотипу можно отделить бактерии, содержащие плазмиды, от бактерий,
лишенных плазмид. Например, R-плазмиды содержат структурные гены,
ответственные за устойчивость к антибиотикам. При высеве бактерий,
содержащих такие R-плазмиды, на среду с антибиотиком они будут рас-
ти и формировать колонии, бактерии, лишенные их, на среде с антибио-
тиком не вырастут.
Резать молекулы ДНК на фрагменты можно с помощью ферментов
рестриктаз. Необходимо подобрать специфическую рестриктазу, которая
имела бы сайты узнавания на двух молекулах ДНК (плазмиде и ДНК, из
которой вырезаются переносимые гены) и резала бы их с образованием
липких концов. Рестриктаза не должна резать ДНК плазмиды в области,
ответственной за репликацию, и в области структурных генов, детерми-
нирующих фенотип плазмиды.
Соединять или сшивать фрагменты ДНК можно с помощью фермен-
тов полинуклеотидлигаз.
Вводить рекомбинантные молекулы ДНК можно с помощью транс-
формации. Рекомбинантной ДНК обрабатывают реципиентные клетки
(клетки, в которые клонируется нужный ген) и через определенный про-
межуток времени выдерживания при оптимальной температуре смесь
высевают на селективную среду, позволяющую отобрать по фенотипу
клоны, воспринявшие плазмиду.
Метод клонирования нашел широкое применение. С его помощью
можно получать микробиологическим путем продукты, использующиеся
человеком. В настоящее время разработаны методы микробиологическо-
го получения гормона инсулина, в котором нуждаются больные диабе-
том. Раньше его получали путем экстрагирования из поджелудочных же-
лез коров, свиней, что очень сложно и дорого. Разработаны методы по-
лучения интерферонов – белков, обладающих антивирусным действием;
соматостатина – гормона роста и др. Гены, детерминирующие синтез
этих веществ, клонированы в основном в клетках E. coli.
|