Компетентностью при генетической трансформации обычно назы-
вается способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать
чужеродную ДНК. Однако в последние годы в это понятие включают и
все последующие стадии, вплоть до рекомбинации трансформирующей
ДНК с хромосомой реципиентной бактерии.
У многих видов бактерий компетентность возникает лишь на опреде-
ленном этапе роста культуры. Например, культуры стафилококков нахо-
дятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста.
Культуры бактерий Bacillus subtilis находятся в стадии компетентности
на более поздних этапах экспоненциального роста, гемофильные бакте-
рии – в стационарной фазе роста. У некоторых бактерий клетки компе-
тентны в любой фазе роста (например, у гонококков и менингококков).
Установлено, что в компетентных культурах стрептококков, гемо-
фильных бактерий к трансформации способна почти каждая клетка. В то
же время у B. subtilis в этих же условиях ДНК могут поглощать только
10–15 % клеток популяции, у Aspergillus niger – 0,1–0,2 %, у Rhizobium
japonicum – до 0,1 % клеток всей популяции.
Состояние компетентности регулируется множеством генов (у ба-
цилл их не менее 40), которые принято подразделять на ранние и позд-
ние. К ранним относятся гены «настраивающие» (подготавливающие)
клетку на приобретение компетентности; к поздним – гены, детермини-
рующие механизмы связывания и поглощения ДНК, преобразования
(или процессинга) ДНК по ходу поглощения; и наконец, гены, управ-
ляющие рекомбинацией трансформирующей ДНК с хромосомой реципи-
ентной клетки.
В ряде научных лабораторий (Р. Пакула, Р. Хочкисс, Р. Томас и др.)
было показано, что состояние компетентности у стрептококков можно
передать от компетентных клеток некомпетентным. Передача состояния
компетентности не требует физического контакта бактерий, потому что
его можно индуцировать посредством фильтратов суспензий бактери-
альных культур. Было сделано заключение, что существует какой-то
внеклеточный фактор, обеспечивающий состояние компетентности.
В тех же лабораториях были изучены некоторые свойства фактора
компетентности бактерий S. pneumoniae, который мог быть выделен по-
сле осаждения сульфатом аммония или этиловым спиртом. Было уста-
новлено, что это пептид, чувствительный к протеазам и относительно ус-
тойчивый к высокой температуре (при нагревании до 100 ºС инактивиро-
вался за 30 мин).
В работах 1990-х годов вместо «фактор компетентности» употребля-
ется термин «феромон». Показано, что феромоны стрептококков явля-
ются катионными пептидами небольшой величины. Например, у S.
pneumoniae они состоят из 17 аминокислотных остатков, у других стреп-
тококков – от 14 до 23 остатков. У B. subtilis феромоны – это пептиды из
9–10 аминокислотных остатков, что объясняет их сравнительно высокую
термоустойчивость.
В поведении феромонов компетентности бацилл и стрептококков
есть общие особенности. Эти небольшие пептиды выходят из компе-
тентных клеток в среду и индуцируют развитие компетентности, активи-
руя все гены компетентности у почти всех клеток популяции стрепто-
кокков или части клеток бацилл.
Восприятие клеткой феромонного сигнала осуществляется за счет
двухкомпонентной передающей системы, состоящей из сенсорного белка и белка-регулятора ответаСенсорный белок состоит из трансмембранного рецепторного доме-на, пронизывающего поверхностные слои клетки и соприкасающегося с
внешней средой, и передающего модуля, находящегося в цитоплазме.
Сенсорными белками часто служит семейство ферментов гистидинкиназ,
обладающих способностью к фосфорилированию. Феромон контактиру-
ет с рецептором, имеющим к нему сродство; сигнал идет к передающему
модулю и от него – к второму компоненту этой системы, белку-регуля-
тору ответа. Передача сигнала происходит посредством фосфорилирова-
ния белка-регулятора с использованием остатков аминокислот гистидина
и аспартата. Фосфорилированный регулятор взаимодействует с промото-
ром того или иного оперона и активирует экспрессию ряда «молчащих»
до сих пор генов, отвечающих за компетентность. В результате метабо-
лизм клетки меняется, иногда коренным образом. К этому и сводится
ответ на феромонный сигнал, полученный рецептором.
Хотя естественная трансформация описана более чем у 50 видов бак-
терий, феромоны компетентности известны лишь у стрептококков и ба-
цилл. Возможно, что у некоторых видов они еще просто не обнаружены;
однако можно считать установленным, что трансформация у таких хо-
рошо изученных микроорганизмов, как гонококки и менингококки, осу-
ществляется без феромонов. Это вполне объяснимо, так как клетки гоно-
кокков и менингококков способны к трансформации в любой стадии
роста культуры: компетентность является их постоянным свойством.
Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от не-
компетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и други-
ми свойствами:
• обладают сниженным уровнем метаболизма;
• более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в попу-
ляции;
• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;
• меньшими размерами, чем некомпетентные;
• изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков ци-
топлазматической мембраны;
• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой
обработке;
• сниженным поверхностным зарядом.
Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует ес-
тественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli,
бактерии рода Erwinia и другие, но несмотря на это, они также могут
быть трансформированы. Для этого их клетки обрабатывают тем или
иным способом, индуцируя у них способность к поглощению ДНК. Наи-
большую известность приобрел метод индукции компетентности с по-
мощью ионов кальция – кальциевый метод. Клетки бактерий выдержи-
вают в присутствии ионов Са2+ (50 мМ) при 0 ºС с последующим кратко-
временным тепловым воздействием при 37 ºС или 42 ºС. В этих условиях
возникает общее состояние компетентности и появляется возможность
осуществления хромосомной и плазмидной трансформации.
Эффективность трансформации повышается при совместном дейст-
вии ионов Са2+ с ионами Mg2+, Mn2+ или Rb+. Кроме того, эффективность
трансформации повышается при увеличении времени инкубирования с
ионами Ca2+, а также при добавлении диметилсульфоксида.
Широко используется также способ индукции компетентности за
счет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При
этом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмидной
ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансфор-
мации. Чтобы получить трансформанты с помощью этого метода, смесь
реципиентных клеток и ДНК донора в присутствии криопротектора
(0,5 % раствора твина-80) замораживают (до –196 ºС), а затем отогревают
при +42 ºС и высевают на селективные среды, позволяющие отобрать
трансформанты.
Механизмы индукции компетентности изучены недостаточно. Пока-
зано, что высокие концентрации ионов кальция и других щелочно-зе-
мельных металлов вызывают структурную реорганизацию клеточных
мембран, а также плазмолиз. В мембранах обнаруживаются полиморф-
ные структурные изменения, образуются участки соединения и слияния
мембран. При этом усиливается мембранная проницаемость, увеличива-
ются размеры периплазматического пространства. В связи с этим пред-
полагается, что ДНК поступает в цитоплазму за счет дефектов в мембра-
нах, а также в участках их слияния.
Возможно, что аналогичные изменения возникают в клетках и под
влиянием других воздействий, индуцирующих компетентность. Выска-
зывается предположение, что в процессе замораживания-оттаивания мо-
лекулы ДНК поступают в цитоплазму путем диффузии через временные
быстро репарируемые дефекты мембран.
В последнее время трансформацию успешно осуществляют с помо-
щью электропорации. Существуют специальные приборы – электропо-
раторы, которые за счет кратковременного воздействия (обычно 5–
20 мс) электрического поля высокой напряженности (1–15 кВ/см) на кле-
точную мембрану приводят к образованию в ней пор (электропробой).
Время существования и размер пор достаточны, чтобы такие макромоле-
кулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате
действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. На-
пряженность электрического поля и продолжительность его действия,
концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каж-
дой системы клеток подбирают экспериментально, для того чтобы до-
биться высокой частоты поглощения ДНК выжившими клетками. Пока-
зано, что в оптимальных условиях электропорации количество образо-
ванных трансформантов может достигать 80 % выживших клеток.
|